Estrutura da OMEGA nickase IsrB em complexo com ωRNA e DNA alvo

May 06, 2023

Nature volume 610, páginas 575–581 (2022) Citar este artigo

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Sistemas guiados por RNA, como CRISPR-Cas, combinam reconhecimento de substrato programável com função enzimática, uma combinação que tem sido usada vantajosamente para desenvolver tecnologias moleculares poderosas1,2. Estudos estruturais desses sistemas iluminaram como o RNA e a proteína reconhecem e dividem seus substratos em conjunto, orientando a engenharia racional para o desenvolvimento tecnológico adicional3. Trabalhos recentes identificaram uma nova classe de sistemas guiados por RNA, denominados OMEGA, que incluem IscB, o provável ancestral de Cas9, e a nickase IsrB, um homólogo de IscB sem o domínio HNH nuclease4. IsrB consiste em apenas cerca de 350 aminoácidos, mas seu tamanho pequeno é contrabalançado por um guia de RNA relativamente grande (aproximadamente 300 nt ωRNA). Aqui, relatamos a estrutura de microscopia eletrônica criogênica de Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB) em complexo com seu cognato ωRNA e um DNA alvo. Descobrimos que a estrutura geral da proteína IsrB compartilha um andaime comum com Cas9. Em contraste com Cas9, no entanto, que usa um lóbulo de reconhecimento (REC) para facilitar a seleção do alvo, IsrB depende de seu ωRNA, parte do qual forma uma intrincada estrutura ternária posicionada de forma análoga ao REC. Análises estruturais de IsrB e seu ωRNA, bem como comparações com outros sistemas guiados por RNA destacam a interação funcional entre proteína e RNA, avançando nossa compreensão da biologia e evolução desses diversos sistemas.

A proteína IsrB guiada por RNA é um membro da família OMEGA codificada na superfamília de transposons IS200/IS605. IsrB é o provável antecedente de IscB, outro membro da família OMEGA que é o ancestral aparente de Cas9, conforme indicado tanto pela análise filogenética quanto pela arquitetura de domínio única compartilhada4,5. Como IscB e Cas9, IsrB contém um domínio de nuclease semelhante a RuvC que é interrompido pela inserção de uma hélice de ponte (BH) (Fig. 1a). No entanto, em contraste com IscB e Cas9, IsrB não possui o domínio HNH nuclease, o lóbulo REC e grandes porções do domínio de interação de motivo (PAM) adjacente ao protoespaçador e, portanto, é muito menor (com aproximadamente 350 aminoácidos) do que Cas9 . IsrB contém adicionalmente um domínio PLMP N-terminal (nomeado após seu motivo de aminoácido conservado) e um domínio C-terminal não caracterizado (Fig. 1b). Trabalhos anteriores mostraram que IsrB se associa a um ωRNA de aproximadamente 300 nt, que orienta IsrB a cortar a fita não-alvo de DNA de fita dupla (ds) contendo um motivo adjacente ao alvo 5'-NTGA-3' (TAM)4 .

a, arquitetura do locus e RNAs guia para IsrB (à esquerda) e Cas9 (à direita). b, Arquitetura de domínio de Streptococcus pyogenes SpCas9 (superior) e D. thermocuniculi IsrB (DtIsrB) (inferior). c, Esquema de IsrB em complexo com o ωRNA e o DNA alvo. O duplex parcial de DNA contendo o TAM e as sequências alvo usadas para o estudo estrutural são mostrados em letras de sequência. d,e, Mapa de densidade Cryo-EM (d) e modelo estrutural (e) do complexo IsrB-ωRNA-DNA alvo. As linhas tracejadas representam regiões mal resolvidas de ωRNA. TE, extremidade do transposon; DR, repetição direta; NUC, nuclease; PI, interação com PAM; PLL, loop de bloqueio de fosfato; TI, interação TAM; TS, cadeia alvo; NTS, fita não-alvo.

Para caracterizar o mecanismo molecular do direcionamento de DNA guiado por ωRNA por IsrB, analisamos um complexo ternário compreendendo Desulfovirgula thermocuniculi IsrB (DtIsrB), um ωRNA de 284 nt contendo um segmento guia de 20 nt, uma fita de DNA alvo de 31 nt e uma fita de DNA de 10 nt -nt fita de DNA não-alvo usando crio-EM de partícula única (Fig. 1c). Obtivemos uma reconstrução tridimensional (3D) do complexo ternário com uma resolução geral de 3,1 Å (Fig. 1d, Extended Data Fig. 1a–c e Extended Data Table 1). Algumas regiões do mapa correspondentes ao ωRNA, entretanto, foram resolvidas em resolução inferior. Para refinar a modelagem das coordenadas de RNA, usamos uma ferramenta de modelagem específica de RNA, auto-DRRAFTER, juntamente com um modelo de estrutura secundária baseado em covariância para construir um modelo inicial de ωRNA. Com base neste modelo ωRNA e um modelo IsrB inicial gerado pela predição da estrutura da proteína, determinamos a estrutura IsrB–ωRNA–DNA (Fig. 1e e Dados Estendidos Figs. 1d,e e 2)6,7,8.